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[器材和試劑]

● 噬菌體緩沖液

● XLl-Blue或者DH5。F，TB細(xì)胞

● IPTG（30mg/m1儲(chǔ)存液，水溶液；儲(chǔ)存在-20℃）

● LB-瓊脂培養(yǎng)基+Amp/X-gal/IPTG

● Luria-Bertani（LB） [L-液體培養(yǎng)基（1％細(xì)菌用胰蛋白胨，0，5％酵母提取物，0．085m01/LNaCl，pH 7．2）]

● LB+Amp（L-液體培養(yǎng)基，50ug/m1 Amp）

● X-gal（30mg/m1儲(chǔ)存液，溶于N，N-二甲基甲酰胺中；暗處儲(chǔ)存在一20℃）

● LB-瓊脂培養(yǎng)基+Amp/Glu[L-瓊脂培養(yǎng)基，50ug/ml Amp，1％葡萄糖]

● 甘油（Sigma）

● M13K07輔助噬菌體（Amersham BioSciences）

● 硫柳汞（Sigma）

 

[方法]

1．用從磁珠上洗脫下來的已中和噬菌體，感染大約5m1 TB細(xì)胞。37℃孵育10分鐘， 勿攪動(dòng)。

2．快速離心以沉淀細(xì)菌細(xì)胞。去除上清，用1-2m1 LB重懸細(xì)胞。將細(xì)胞在直徑15mm的LB-瓊脂培養(yǎng)基+Amp/Glu平板上鋪板，37℃下孵育過夜，zui大密度為每板5×10³個(gè)細(xì)胞。

3．次日，用接近10ml的LB牛10％甘油刮取細(xì)胞。小量分裝并儲(chǔ)存在-20℃。

4．在20mlLB+Amp中孵育細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度到OD₆₀₀≈0．05， 然后劇烈振搖（至少300r/min）培養(yǎng)至光密度OD₆₀₀≈0．25。

5．在37℃下孵育細(xì)胞15分鐘，極溫和地?cái)噭?dòng)。

6．用輔助噬菌體M13K07超感染細(xì)菌培養(yǎng)物（感染復(fù)數(shù)moi＝30）。加入IPTG（終濃度為0．1mm01/L），溫和攪動(dòng)10分鐘，在37℃下劇烈振搖孵育5小時(shí)。

7．以5000r/min 4℃離心細(xì)菌/噬菌體懸液30分鐘， 回收上清。在LB-瓊脂培養(yǎng)基+Amp/X-gal/IPTG平板上，滴定噬菌體上清的TU（通常滴度在l×l0¹⁰Tu/m1以上）。將噬茵體上清液小量分裝，再加入0．05％硫柳汞儲(chǔ)存。

8．加入PEG 8000和NaCl溶液（終濃度分別為4％和0，5mol/L）沉淀噬菌體顆粒，然后4℃冰上孵育2～4小時(shí)。

9．4℃5000r/min離心40分鐘回收噬菌體沉淀，再以原溶液體積的1/10 TBS重懸沉淀。

10，70℃水浴中孵育噬菌體懸液30分鐘，使污染的細(xì)菌蛋白變性； 以4℃10000r/min離心30分鐘去除之。

11．以TU為單位在LB-瓊脂培養(yǎng)基+Amp/X-gal/IPTG平板上滴定噬菌體懸液。次輪淘洗需用10⁹- 10¹¹個(gè)噬菌體。