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制備用于抗原上選擇的噬菌體抗體
閱讀：864 發布時間：2010-11-29轉化后，就得到了菌苔形式的抗體文庫。可以制備成甘油儲存物保存于一80℃。這是一個原始文庫，象征著具有*價值的資源。的抗體文庫也是由這種原始文庫制備而來的。然而，當用大培養板鋪板擴增原始文庫時，會造成部分多樣性的丟失。因此在任何噬菌體制備或細菌擴增步驟中，接種量必須總是大于5倍的文庫容量，從而保持文庫的多樣性。
在大多數噬菌體展示載體中，抗體片段的表達是由lacZ啟動子啟動的。盡管這個啟動子存在某些漏洞并可以優化，但以以下一些指導進行操作，其效果依然良好。在噬菌體救援前，含有抗體文庫的細菌在葡萄糖存在的條件下，可生長至對數期。葡萄糖可抑制lacZ啟動子的活性，因此使pⅢ和抗體表達都下降。這就有兩點重要作用：一是由于pⅢ和抗體產生的毒性下降，防止了文庫的偏性發生；二是抑制了pⅢ表達就可允許細菌纖毛表達，從而使輔助噬菌體能進行感染。如果沒有葡萄糖，感染效率會急劇下降，結果大大降低了抗體文庫的有效容量：輔助噬菌體感染后，則須去除葡萄糖，以便讓pⅢ和抗體進行表達。而后，低水平lacZ啟動子驅動pⅢ表達，但這已足以進行有效的展示了。用異丙基硫代半乳糖苷（1PTG）誘導啟動子達不到預期效果，反而大大降低了展示水平。這是由pⅢ和抗體融合蛋白的毒性及pⅢ抗體融合蛋白的降解所致。對于scFv文庫和Fab文庫，過夜生長階段的典型溫度是30℃；此溫度下，抗體展示水平似乎更佳。選擇前，先用PEG沉淀法從培養基上清中制備噬菌體。這樣就可以去除不*抑制或蛋白水解切除所產生的抗體片段。這些抗體片段能與噬菌體競爭結合。PEG沉淀也可以去除其他任何能干擾選擇的污染物。如果計劃長期保存噬菌體，推薦接著進行氯化銫離心純化。
自抗體文庫儲存料中制備噬菌體。在開始實驗之前，先用滴定法（在TYE/amp/glu平板上系列稀釋鋪板）計算每毫升抗體文庫儲存料中細菌的數目。在600nm（A600）處的某個特定吸光值下，抗體文庫中細菌數目較未感染細菌數目低一些。這或許是因為含有質粒的文庫細菌體積更大，或者是存在死細菌。一旦滴度與A600確定關系，吸光值即可用于細菌數目的計算。對于噬菌體的制備（文庫救援），來自文庫儲存料的起始接種量應比文庫容量大5倍。接種到培養基后，細菌濃度的A600不應超過0．05。采用文庫容量5倍以上的細菌接種以確保它能呈現出文庫中的所有成員。而培養起始的A600小于0．05，則可以確保輔助噬菌體加入前處于多倍增長期，以提高輔助噬菌體感染的有效性。用于救援的zui小培養體積必須根據文庫容量和0．05的zui大起始A600值來確定。例如，含有1．0×l010個成員的抗體文庫所需要的起始接種量為5．0×l0l0個細菌。因為1．0A600＝1．0×109，為保證起始培養液A600值小于0．05，則需要1L的培養體積。此體積的培養液應平均分到兩個含有250ml 2×TY/amp/glu培養基的2L錐形瓶中。葡萄糖會抑制pⅢ的表達，但允許纖毛的表達。
使用新鮮制備的噬菌體才會得到*選擇結果。這是因為即便在-80℃下保存，展示抗體也會隨時間的推移而出現緩慢的蛋白水解。應用氯化銫梯度離心法純化菌體，能顯著降低蛋白的水解。這樣純化后，蛋白質會非常穩定。預期產量是每毫升原始培養液產生（1～5）×101l個噬菌體，而氯化銫純化后產量會下降50％。