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胞外轉錄反應
閱讀：925 發布時間：2010-11-25由于RNA聚合酶一般由數個次單元組合而成，早先要在試管內應用RNA聚合酶的轉錄活性合成RNA并非易事，但這個問題在SP6, T3 及T7 等噬菌體的RNA聚合酶陸續被發現以后，情況已*改觀。這主要是因為這類RNA聚合酶由一條多勝肽 （polypeptides） 所構成，其在進行轉錄反應時所須辨認的啟動子長度僅20bp左右，而且轉錄起始位置非常明確，轉錄效能良好，成了目前進行胞外轉錄反應時的*選擇。要進行胞外轉錄反應時，僅需將目標基因次選殖 （subclone）至帶有SP6, T3 或T7 啟動子的轉錄載體，或者運用PCR技術在基因的一端加上SP6, T3 或T7 啟動子的序列，即可運用對應的RNA聚合酶活性在試管內合成正意股或反意股RNA。 以質體DNA為模版進行胞外轉錄反應前，應先用限制酶自目標基因的一端切開，以免轉錄反應持續進行至載體的序列 （run-on），但在選擇限制酶切位時應避免使用目標基因也帶有的切位；限制酶內切好的質體DNA經phenol/chloroform萃取的后，即可用來進行。
儀器用具：微量離心機
藥品試劑： Plasmid DNA 酵解產物pBlueGus/HindIII 及pBlueGus/BamHI；5×Transcription buffer （200 mM Tris-Cl, pH 8.0; 40 mM MgCl2; 10 mM；spermidine-（HCl）3; 125 mM NaCl; Roche）NTPs （含ATP, CTP, GTP 及UTP 各2.5 mM）；RNase 抑制劑RNasin （40 U/μL）；T7 與T3 RNA polymerase （Roche） ；dH2O/DEPC；100 mM DTT （dithiothreitol）；DNase （RNase-free）
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol （25:24:1）, 以下簡稱PCI；Chloroform/isoamyl alcohol （24:1）, 以下簡稱CI
方法步驟：
1） 取4 支1.5 mL 微量離心管，分別標示 #1, #2, #3 與 #4，再依下表依序在#1 與 #2 加入所需各項試劑 （單位 μL）：
?? 注意： 在逐一加入各項反應試劑時，微量離心管維持于室溫即可，以免在低溫時，DNA 遇到轉錄緩沖液所含spermidine 產生沉淀。進行下列實驗時，請務必戴手套！
2） 以手指頭輕彈離心管壁使混合均勻，離心數秒后放置于37℃恒溫水槽作用1 h。
3） 反應結束時，自 #1 與 #2 分別取出4 μL反應物，放到微量離心管 #3 與 #4中，將 #3 與 #4 存放于 -20℃冷凍柜中。
4） 取1 μL DNase 加到 #1 與 #2，混合均勻后放置于37℃作用15 min，以便去除DNA 模版。
5） 反應結束后，加入53 μL dH2O/DEPC，以100 μL PCI萃取一次，劇烈震蕩后，離心14,000 rpm 5 min。
6） 以微量移液器P200 將上層液移至一新的微量離心管，下層的PCI以100 μLdH2O/DEPC反萃取 （back-extraction） 一次。
7） 以微量移液器P200 將上層液移至步驟6） 的新離心管。
8） 估計兩次上層液聚集的后的總體積，并以等體積的CI 萃取一次，劇烈震蕩后，離心14,000 rpm 5 min。
9） 以微量移液器P200 將上層液移至一支新的微量離心管，加入0.1 倍體積的3 M NaOAc （pH 5.2） 及2.5 倍體積的酒精。
10） 混合均勻，并置于 -20℃過夜，以便沉淀RNA。
隔天：
1） 自冷凍柜取出微量離心管，以14,000 rpm 于4℃離心10 min。
2） 仔細移去上清液的后，加入0.5 mL 70%酒精。
3） 以14,000 rpm 于4℃離心5 min。
4） 去除上清液的后，將微量離心管倒置于一張干凈的衛生紙上大約30 min，以便風干RNA。
5） 以10 μL dH2O/DEPC溶解RNA沉淀