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生物素標記肽的檢測方法
閱讀：1945 發布時間：2010-11-24 1．準備工作
該檢測是在96孔微板上進行，每孔均先用鏈霉親合素包被，分別依次加入待進行表位作圖的肽系列，并用需定位的抗體檢測。
2．試劑和溶液
0．1％PBS-Tween；
2％BsA／PBS；
0．1％（wt／v01）BSA／PBS；
肽；
過氧化物酶標記的第二抗體；
TMB底物（取50／xl 50g／LTMB儲存液，加入5ml 0．1m01醋酸鈉，pH 6．6，另加1ul過氧化氫）；
100 btmol硫酸。
3．操作步驟
（1）干肽溶于100％DMSO中，使其貯存液的濃度為10mg／m1，工作液的終濃度為lmg／ml，貯存于—70℃。
（2）用5／Ig／m1鏈霉親和素（去離子水稀釋）包被96孔板每孔50pl，注意設立復孔。37℃孵育過夜。
（3）用0．1％PBS-T洗板4次，用2％BSA／PBS封閉非特異性結合位點，室溫2h。用0．1％PBS-Tween洗滌。 ．
（4）將肽用0．1％（重量／體積）BSA／PBS稀釋至終濃度為5／（g／m1（用工作原液的1／200稀釋），每孔加入50txl肽溶液，濕盒置室溫孵育2h或者過夜。
（5）從孔中吸去肽，并用0．1％PBS-T洗板4次。
（6）加入待測抗體。如用雜交瘤細胞培養上清液，可用原液或稀釋1／10倍（用0．1％PBS-T）稀釋。多克隆血清應稀釋至1／200—1／2000進行試驗，而純化抗體應該在1—10bg／ml。
（7）孵育2h或過夜，吸去抗體溶液，用0．1％PBS-T洗板4次。然后加入過氧化物酶標記的二抗（兔抗鼠IgG單克隆抗體，用5％FCS／PBS作1／1000稀釋），室溫孵育2h。
（8）洗板4次，加入TMB底物，每孔50／J1，即50ml（50g／L）TBM儲備液中加入5ml醋酸鈉pH6．6及lml過氧化氫。
（9）出現藍色時，加入lOOmmol／L硫酸50／1l終止反應。在450nm波長下測其OD值。
在一個成功的實驗中，一系列肽根據表位的大小以及所選擇肽的重疊程度，其中1個、2個或者3個肽可以得到強陽性的信號。例如，一個長度為15個氨基酸的肽鏈，有5個氨基酸重疊，那么，有些抗體可以與定位于5個氨基酸中的3個肽結合即產生強陽性信號。相反，另外一些抗體，與位于10個氨基酸表位中的2個肽結合產生陽性信號。某些抗體（極少數）僅對整條肽鏈顯示1個陽性信號。這就意味著，氨基酸對于表位是至關重要的，常常定位于抗原的15個氨基酸區域中。
如果其他肽的背景染色很淺，可以認為就是很好的內在對照。一般而言，陽性肽不加試驗性一抗，僅加檢測試劑，應沒有任何特異性信號。如果需要的話，表位分析可以通過氨基酸替換新的肽系列進行試驗，一般使用丙氨酸（alanine）進行每一氨基酸位點的替換（在某些情況下，亦可以替換其他19個氨基酸）、轉位替換一段肽或者重復氨基酸片段。