用噬菌體ElISA快速鑒定噬菌體展示蛋白的結合親和性

    單價噬菌體展示系統能使一個單獨的蛋白質（或多肽）分子呈遞在噬菌體顆粒表面，這樣的蛋白質與野生型pⅢ衣殼蛋白相連，作為融合蛋白在輔助噬菌體感染的大腸桿菌細胞中，由噬菌粒載體翻譯表達出來。這種展示系統能實現單價展示，是由于這種融合蛋白極少替代來自輔助噬菌體基因組的野生型pⅢ蛋白。這種展示可以是高度可變的，而這時這些噬菌體通常只有0.05％一5％才能真正展示出需要的蛋白質。

    單價噬菌體展示的主要優點是排除了多價噬菌體展示時會遇到的親和效應（avidityeffect）。這樣保證了篩選的性，能把具有很高親和性（如Kd≈lnmol/L）的不同變異體區別開來。這種技術的應用，包括提高了結合親和性或改變了結合特異性[1）的多肽的生成。實際上，這個過程中zui費勁的部分就是對篩選出的突變蛋白的鑒定。

    現在已有兩種方法能加快對篩選出的蛋白的結合親和性的分析。一種方法是在被展示蛋白和作為錨定的pⅢ衣殼蛋白中插入琥珀中止密碼子，這樣，游離蛋白就能在非（琥珀）抑制性菌株中進行表達。這樣便能使用分析結合性的標準方法，對于提率是一種改進[61。不幸的是，這個方法的應用受到一種趨勢的影響，即由有義密碼子（sense codon）代替琥珀終止密碼子而產生的變異體在篩選出的文庫中占優勢，因為由于融合蛋白的表達和展示的提高，這種噬菌體具有巨大的選擇優勢。尋找一個替代的方法，以忽略終止密碼子并能將每個基因都亞克隆人一個表達載體，顯然是更費力的。

    第二種方法，也是本章的重點，是將噬菌體顆粒本身作為游離蛋白的替代物，以測定結合性。通過在溶液中不斷地加入靶標蛋白，來競爭替代與噬菌體結合的固定化靶標蛋白，然后進行噬菌體結合性檢測。這種技術能快速地分析從單價噬菌體展示系統的篩選中分離出的變異體，也能用于評價那些用其他方法難以表達的定向變異體的親和性。用噬菌體結合性檢驗方法來對結合親和性進行評估是很困難的，因為一個關鍵的變量，即被展示的蛋白質的濃度是未知的。不過，對于一系列的變異體，則有可能得到ECso的比值，而這與它們的解離常數的比值是緊密相關的[7）。本章主要描述了在設計噬菌體結合性檢測時需要考慮的一些重要參數，并為怎樣進行這些檢測提供了詳細的示例實驗方案。

    噬菌體結合性檢測為鑒定大量的噬菌體并挑選出對后續實驗zui合適的變異體提供了一種快速的方法。這種檢驗對于了解噬菌體展示技術的潛力同樣是一個有效的手段。然而，噬菌體結合性檢測并不能zui終測定結合的親和性。無數的因素都能影響到結合的結果，包括噬菌體上融合蛋白的展示水平、未知的翻譯后修飾以及由展示蛋白的增加引起的親和效應等。為了消除與噬菌體展示相關的可能的假象，有必要使用傳統的對純化后蛋白結合性的分析方法，對這些檢測試驗鑒定出的*變異體進行檢驗和鑒定。

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