大腸桿菌宿主殘留蛋白（E.coli P） ELISA試劑盒使用說明書

     本試劑僅供研究使用                  
目的：本試劑盒用于測定血清，血漿及相關液體樣本中大腸桿菌宿主殘留蛋白（E.coli P）的含量。

實驗原理：

   本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大腸桿菌宿主殘留蛋白（E.coli   P）水平。用純化的

大腸桿菌宿主殘留蛋白（E.coli P）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次

加入大腸桿菌宿主殘留蛋白（E.coli P），再與HRP 標記的E.coli P  抗體結合，形成抗體-抗原-

酶標抗體復合物，經過*洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉化成藍色， 并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大腸桿菌宿主殘留蛋白（E.coli P） 呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣品中大腸

桿菌宿主殘留蛋白（E.coli P）濃度。

試劑盒組成：

    試劑盒組成                 48 孔配置                96 孔配置                保存

      說明書                   1 份                    1 份

      封板膜                2 片（48 ）               2 片（96）

      密封袋                   1 個                    1 個

    酶標包被板                   1×48                  1×96             2-8℃保存

  標準品：36ng/L             0.5ml×1 瓶              0.5ml×1 瓶          2-8℃保存

   標準品稀釋液                1.5ml×1 瓶              1.5ml×1 瓶          2-8℃保存

     酶標試劑                 3 ml×1 瓶              6 ml×1 瓶           2-8℃保存

    樣品稀釋液                 3 ml×1 瓶              6 ml×1 瓶           2-8℃保存

    顯色劑A 液                3 ml×1 瓶              6 ml×1 瓶           2-8℃保存

    顯色劑B 液                3 ml×1 瓶              6 ml×1 瓶           2-8℃保存

      終止液                 3ml×1 瓶               6ml×1 瓶            2-8℃保存

  20 倍濃縮洗滌液              20ml ×1 瓶              23ml ×1 瓶          2-8℃保存

樣本處理及要求：

1.  血清：室溫血液自然凝固10-20 分鐘，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上

   清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。

2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20 分鐘后，離心

   20  分鐘左右（2000-3000  轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次

   離心。

3.  尿液：用無菌管收集，離心20  分鐘左右（2000-3000  轉/分）。仔細收集上清，保存過程

   中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS                     （PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞

   濃度達到100 萬/ml 左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20 分

   鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?/span>

   用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS                        （PH7.4），用手工或勻漿器

   將標本勻漿充分。離心20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待

   檢測，其余冷凍備用。

6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上

   進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP ）活性。

操作步驟

1.  標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10 孔，在*、第二孔中分別加標

    準品100μl，然后在*、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后從*孔、第二

    孔中各取100μl 分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，

    混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl 棄掉，再各取50μl 分別加到第五、第六孔

    中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各

    取50μl 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混

    勻后從第七、第八孔中分別取50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準

    品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl 棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，

    濃度分別為24ng/L，16ng/L  ，8ng/L，4ng/L， 2ng/L）。

2.  加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣

    品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl （樣

    品zui終稀釋度為5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混

    勻。

3.  溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。

4.  配液：將20 倍濃縮洗滌液用蒸餾水20 倍稀釋后備用。

5.  洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此

    重復5 次，拍干。

6.  加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7.  溫育：操作同3。

8.  洗滌：操作同5。

9.  顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色

    15分鐘.

10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

11. 測定：以空白空調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應在加終止

    液后15 分鐘以內進行。

注意事項：

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未

   用完，板條應裝入密封袋中保存。

2．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。

3．各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間

   控制在5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。

4．請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD 值

   大于標準品孔*孔的OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n 倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數（×n×5）。

5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物請避光保存。

7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.

8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

9．本試劑不同批號組分不得混用。

10.  如與英文說明書有異，以英文說明書為準。

計算：

    以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，

    在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD

    值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋

    倍數；或用標準物的濃度與OD 值計算出標

    準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值

    代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋

    倍數，即為樣品的實際濃度。

                                                              （此圖僅供參考）

試劑盒性能：

1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R 值為0.990 以上。

2.批內與批見應分別小于9%和11%

檢測范圍：

   1ng/L -30ng/L

保存條件及有效期：

1.試劑盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6 個月

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