CSA法和改進(jìn)CSA法的敏感性和存在的問題

    提高IHC敏感性有幾種途徑。一是依靠各種IHC的前處理，例如酶的消化、高溫的抗原修復(fù)，雖然對其的基本原理不十分清楚，但卻十分實用；其次是增加IHC方法的放大倍數(shù)，主要是酶結(jié)合量的增加。例如EnVison法，一個EnVision葡聚糖多聚物結(jié)合100個左右的酶分子和15個抗體分子，要比二步法S-P（LSAB）上結(jié)合的酶分子多許多倍。

    雖然EnVision法的敏感性大大提高，方法也簡便，但其大分子對于核內(nèi)抗原的定位就不如LSAB法，存在穿透核膜困難的問題。因而，有時EnVision法就不如LSAB法敏感，尤其是活細(xì)胞核內(nèi)抗原定位更為困難。CSA法的應(yīng)用，既克服了LSAB法敏感性不高的缺點，又保留了較好的細(xì)胞穿透性。

    已有的研究結(jié)果證實（Hasui K，2005；倪燦榮等，1999），CSA法較LSAB法敏感500—1000倍，較EnVision法敏感20～100倍。其對細(xì)胞周期素等核內(nèi)抗原的定位，有*的優(yōu)點，定位準(zhǔn)確性、敏感性、穩(wěn)定性要較標(biāo)準(zhǔn)的CSA法好，其敏感性和穿透性要好于EnVision法。

    zui近，Hasui K等（2005）的研究結(jié)果表明，CSA法具有很高的敏感性的同時，也存在嚴(yán)重的內(nèi)源性物質(zhì)干擾（內(nèi)源性生物素、內(nèi)源性過氧化物酶、*抗體與組織細(xì)胞內(nèi)的不明物質(zhì)的非特異性結(jié)合），尤其是經(jīng)抗原熱修復(fù)后情況更為嚴(yán)重。作者應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的EnVision法、CSA法和改進(jìn)（加阻斷劑）的CSA法檢測淋巴結(jié)、正常肝、肝細(xì)胞癌、胃腸道鱗癌及癌周正常組織中k167抗原，其檢測*效果的標(biāo)準(zhǔn)流程如下。

    （1）4um石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，PBS洗3x3min。

    （2）首先用0．3％過氧化氫甲醇破壞內(nèi)源性過氧化物酶的活性，室溫20min。

    （3）PBS洗3x3min。

    （4）抗原修復(fù)，室溫冷卻20min。

    （5）PBS洗3x3min。

    （6）第二次用0．3％過氧化氫PBS破壞內(nèi)源性過氧化物酶的活性，室溫5min。

    （7）用溫的（35℃）TBST[0．02mol／L（pH7．8）Tris—HCl+NaCl+0．1％Tween20]洗3x3min。

    （8）滴加蛋白阻斷劑（0．25％酪蛋白），以阻斷*抗體的非特異性結(jié)合位點，10min，不洗。

    （9）滴加適當(dāng)稀釋的*抗體（在S-P法基礎(chǔ)上5—10倍稀釋），或4℃過夜。

    （10）PBS洗3x3min，溫的（35℃）TBST洗3x3min。37~C孵育15～60min，

    （11）滴加蛋白阻斷劑（0．25％酪蛋白），以阻斷多聚物試劑的非特異性結(jié)合位點，lOmin，不洗。

    （12）多聚物（EnVision）孵育15min，溫?zé)?/span>（35℃）TBST洗3x3min。

（13）滴加蛋白阻斷劑（0．25％酪蛋白），以阻斷CSA試劑的非特異性結(jié)合位點，10min，不洗；如用熒光素標(biāo)記酪胺需用TBST洗3次。

（14）用生物素標(biāo)記酪胺孵育15rain；如用熒光素標(biāo)記酪胺孵育15～30rain。溫?zé)?/span>（35~C）TBST洗3X3min。

    （15）鏈霉親和素—HRP 37~C孵育15rain或HRP標(biāo)記的抗FITC抗體孵育30rain，溫的（35℃）TBST洗3X3min。

    （16）0．04％DAB（含0．03％Hz02）顯色5～10min。

    （17）復(fù)染、脫水、常規(guī)樹膠封固和結(jié)果觀察。

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