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關于蛋白質綴合的方案你了解多少?

時間:2022/3/22閱讀:940
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關于蛋白質綴合的簡捷方案你了解多少?以下是使用SMCC和DTT詳細說明PE-蛋白質綴合的方案,供參考。
注意:該方案使用IgG(MW:150kDa)作為其綴合蛋白,但是其他蛋白質可以用適當修飾的量替代。

PE準備
注意:如果PE作為溶液(通常為硫酸銨)儲存,則必須首先進行離心分離。離心并棄去上清液,然后在PBS中以與原溶液相同的濃度重建沉淀物。
如果PE以固體形式儲存,立即懸浮在PBS中。
對于計劃結合的每mg IgG,使用3.5 mg PE。
1.將PE溶液透析,每1升PE對1升PBS進行透析。重復一次。
2.對每升PE的1升透析緩沖液*透析PE溶液。
3.通過測量280,565和620 nm處的吸光度來確保PE溶液的純度。得到的565 / 620nm讀數大于50的比率是藻藍蛋白去除的指標,并且565/280比率大于5表明溶液的進一步純度。

PE衍生化(SMCC-PE)
1.在其用于以下步驟和綴合之前,立即在DMSO中制備10mg / mL SMCC原液。
2.每mg PE將11μlSMCC溶液加入到步驟1b產生的PE溶液中。將溶液包裹在鋁中,孵育1小時,旋轉。
3.用交換緩沖液*平衡凝膠過濾柱,并將前一步驟中的衍生化PE通過其上。

減少IgG
1.在蒸餾水中制備1M DTT(15.4 mg /100μl)溶液。
2.在4mg / mL或更高的適當緩沖液中制備IgG。
3.通過在混合的同時每mL IgG溶液添加20μlDTT原液來產生20mM IgG溶液。在沒有額外混合的情況下,站立30。
4.用交換緩沖液平衡過濾柱,并將還原的IgG通過。從柱中收集0.25mL餾分并以大多數池合并。
一旦完成該步驟,就完成以下結合,并且完成步驟2(同時)。

共軛
1.每mg還原的IgG溶液加入3.2mg SMCC-PE。用鋁包裹并在室溫下旋轉1小時。
2.準備10 mg NEM在1 mL DMSO中的溶液。
3.每mg IgG向IgG溶液中加入34μg。再次包裹鋁并在室溫下旋轉20分鐘。
4.可以將最終溶液透析或在柱上運行到合適的緩沖液中。
注意:不要凍結結合物。

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