作者：
田彥寶 程路
煙草葉樣品的冷凍斷裂SEM圖像
含水植物樣品，例如煙草葉，如果要放入掃描電鏡的真空樣品倉內穩定觀察，首先做好必要的樣品制備處理。樣品制備方法可分為兩類，脫水干燥處理方法和冷凍制備方法，分別對應常溫掃描電鏡觀察和冷凍掃描電鏡觀察。臨界點干燥和冷凍升華干燥是常見的兩種生物樣品脫水干燥處理方法，而冷凍制備方法通常是將含水樣品快速冷凍后再傳送到掃描電鏡的冷凍臺上進行低溫觀察。這三種處理方法都可以借助相應的徠卡電鏡制樣儀器完成，本文主要介紹臨界點干燥和冷凍制備方法的實驗流程和實驗結果對比。
煙草葉樣品完整的臨界點干燥實驗流程包括化學固定、梯度脫水、臨界點干燥和常溫鍍膜等幾個主要步驟。如下圖所示：
化學固定和梯度脫水的步驟繁多，可以手工完成或采用徠卡EM TP自動組織處理機完成；徠卡EM CPD300臨界點干燥儀能對樣品進行脫水干燥處理；徠卡EM ACE200/600可以對干燥后的樣品進行鍍膜，以增加表面導電性。實驗細節參數是結果成敗的關鍵因素，以下參考徠卡用戶英國杜倫大學的M.Goldberg博士和C.Richardson博士提供的應用文檔，列出了實驗中各步驟的參數。
1、固定和脫水：
①2%多聚甲醛，2.5%戊二醛，0.1M Cacodylate緩沖液，2小時；
②pH 7.3，0.1M Cacodylate鈉緩沖液清洗，2x 10分鐘；
③1% OsO4水溶液，1至2小時；
④蒸餾水清洗3x 10分鐘；
⑤乙醇脫水：50% 10分鐘、70% 10分鐘、95% 10分鐘、100% 3x 10分鐘。
2、EM CPD300臨界點干燥的參數：
3、EM ACE600磁控濺射鍍膜Pt 3nm.
最后采用常溫掃描電鏡拍攝，圖像如下：
臨界點干燥法制備的煙草葉樣品
臨界點干燥法制備的煙草葉樣品
煙草葉葉片的冷凍電鏡制樣實驗流程包括樣品快速制冷、真空冷凍轉移、真空冷凍鍍膜、真空冷凍斷裂和升華蝕刻（如有必要）、真空冷凍轉移和冷凍掃描電鏡觀察等幾個主要步驟。如下圖所示：
其中EM VCM是冷凍工作站，用于煙草葉樣品的冷凍及裝載；之后通過EM VCT500轉移到EM ACE600高真空鍍膜儀中進行冷凍鍍膜，如需觀察斷裂面，則用EM ACE600的斷裂裝置斷開樣品后，升華蝕刻后再鍍膜；常溫SEM掃描電鏡或FIB聚焦離子束加裝了EM VCT500適配的冷凍樣品臺，可以通過EM VCT500轉移樣品進行冷凍SEM拍攝。
以下實驗結果是中科院遺傳與發育生物學研究所的田彥寶老師采用上述實驗流程制樣之后，拍攝煙草葉樣品的冷凍掃描電鏡圖像：
煙草葉樣品表面的SEM圖像
煙草葉樣品表面的SEM圖像
煙草葉樣品冷凍斷裂面的SEM圖像
相比于臨界點干燥方法，冷凍制備方法無需繁瑣的化學固定過程，樣品的微觀形貌細節也保存得更好，在觀察樣品內部結構的斷裂面方面，更是有不可比擬的優勢。但冷凍制備方法所涉及到儀器操作復雜度有所增加，制備的樣品無法長期保存，用戶需綜合考慮實驗室的硬件條件和實驗觀察目標選擇合適的實驗方案。
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