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石蠟切片免疫組化染色步驟

閱讀:1563      發布時間:2013-6-17
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1、載玻片的處理: 抗原修復過程中,由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響,極易造成脫片。為保證試驗的正常進行,可選用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等幾種試劑,對已清洗的載玻片進行處理。具體方法如下:
1.1 APES:現用現配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中,停留20~30秒鐘,取出稍停片刻,再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結合的APES,置通風櫥中晾干即可。用此載玻片撈片時應注意組織要一步到位,并盡量減少氣泡的存在,以免影響染色結果。
1.2 HistogripTM:將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的Histogrip液中,停留1~2分鐘,然后用雙蒸水快速清洗三次,室溫干燥或60oC烤箱烘烤一小時,裝盒備用。
1.3 Poly-L-Lysine:將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中,浸泡5分鐘,60oC烤箱烘烤一小時或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗中使用的器具均為非玻璃制品。
2、常用酶消化: 2.1 胰蛋白酶:一般使用濃度為0.05%~0.1%,消化時間為37℃、10~40分鐘,主要用于細胞內抗原的顯示。2.2 胃蛋白酶:一般使用濃度為0.4%,消化時間為37℃、30~180分鐘,主要用于細胞間質抗原的顯示,如:Laminin(層粘蛋白),Collagen IV(IV型膠原)等。 2.3 g/ml的saponin溶液,消化時間為室溫孵育30分鐘。m皂素(Saponin):一般使用濃度為2~103、抗原熱修復:
可根據實驗室的具體條件,選用微波爐抗原修復、高壓鍋抗原修復或水浴高溫抗原修復。抗原熱修復可選用各種緩沖液,如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等,但實驗證明,以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)效果。請選用我公司提供的ZLI-9064  0.1,如因蒸餾水本身造成的pH值偏差,請自行調整。±枸櫞酸鹽緩沖液(粉劑)配制,取該粉劑一包溶于1000ml的蒸餾水中,混勻,其pH值在6.0
3.1 石蠟切片微波爐抗原修復操作方法:切片脫蠟至水后,3%H2O2處理10分鐘,蒸餾水洗2分鐘×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)的容器中,置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在92℃~98℃之間并持續10~15分鐘(注意:無論是使用醫用或家用微波爐,請根據具體機型酌情設置條件,務必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求)。取出容器,室溫冷卻10~20分鐘(注意:不可將切片從緩沖液中取出冷卻,以便使蛋白能夠恢復原有的空間構型)。PBS洗,下接免疫組化染色步驟。
3.2 石蠟切片高壓抗原修復操作方法:切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上,放入鍋內,使切片位于液面以下,蓋鍋壓閥。當壓力鍋開始慢慢噴氣時(約加熱5~6分鐘后),計時1~2分鐘,然后將壓力鍋端離熱源,冷水沖至室溫后,取下氣閥,打開鍋蓋,取出切片,蒸餾水洗后,PBS洗2分鐘×3,下接免疫組化染色步驟。
3.3 石蠟切片電爐煮沸抗原修復操作方法:切片脫蠟至水后,放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)的容器中,并將此容器置于盛有一定數量自來水的大器皿中,電爐上加熱煮沸,從小容器的溫度到達92℃~98℃起開始計時15~20分鐘,然后端離電爐,室溫冷卻20~30分鐘,蒸餾水沖洗,PBS洗,下接免疫組化染色步驟。
 

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