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　　DEAE-SephadexA-50（二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50）為弱堿性陰離子交換劑。用NaOH將CL^-型轉(zhuǎn)變?yōu)镺H^-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白屬于中性蛋白（等電點(diǎn)為PH6.85～7.5），其余均屬酸性蛋白。在PH7.2～7.4的環(huán)境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通過(guò)柱層析γ球蛋白便可在洗脫中先流出,而其他蛋白則被吸附在柱上,從而便可分離獲得純化的IgG。DEAE-sephadexA-50柱層析是離子交換層析的一種。

　　（二）試劑和器材

　　1、試劑:

　　（1）鹽析提取的人γ球蛋白；

　　（2）0.5N NaOH，0.5N HCl 2M NaCl，10％NaN3；

　　（3）DEAE-Sephadex A-50，聚乙二醇（PEG）；

　　（4）0.1M, PH7.4 PB（配制見(jiàn)鹽析部分）；

　　2、器材:

　　（1）層析玻璃柱（1.3×40cm），滴定鐵架，自由夾，螺旋夾，尼龍紗（200目）；

　　（2）普通冰箱，751桮型紫外分光光度計(jì)，電導(dǎo)儀、抽濾裝置（包括抽氣機(jī)、干燥瓶、布氏漏斗、橡皮墊圈、抽濾瓶），PH計(jì)；

　　（3）透析袋、座標(biāo)紙、濾紙、PH精密試紙；

　　（4）量筒、燒杯、試管、吸管、滴管、滅菌小瓶等。

　　（三） 操作步驟

　　1、DEAE-Sephadex A-50預(yù)處理

　　稱DEAE-Sephadex A-50（下稱A-50）5克，懸于500ml蒸餾水，1小時(shí)后傾去上層細(xì)粒。按每克A-50加0.5N NaOH 15ml的比例，將A-50浸泡于0.5N NaOH中，攪勻，靜置30分鐘，裝入布氏漏斗（墊有2層濾紙）中抽濾，并反復(fù)用蒸餾水抽洗至PH呈中性；再以0.5N HCl同上操作過(guò)程處理，zui后以0.5N NaOH再處理一次。處理完后，將A-50浸泡于0.1M，PH 7.4 PB中過(guò)夜。

　　2、裝柱

　　（1）將層析柱垂直固定于滴定鐵架上，柱底墊一園尼龍紗，出水口接一乳膠或塑料管并關(guān)閉開(kāi)關(guān)。

　　（2）將0.1M，PH7.4 PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入經(jīng)預(yù)處理并以同上緩沖液調(diào)成稀糊狀的A-50。待A-50凝膠沉降2-3cm厚時(shí)，啟開(kāi)出水口螺旋夾，控制流速1ml/分鐘，同時(shí)連續(xù)倒入糊狀A(yù)-50凝膠至所需高度。

　　（3）關(guān)閉出水口，待A-50凝膠*沉降后，柱面放一園形濾紙片，以橡皮塞塞緊柱上口，通過(guò)插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。

　　3、平衡:啟開(kāi)出水口螺旋夾，控制流速12-14滴/分鐘，使約2倍床體積的洗脫液流出。并以PH計(jì)與電導(dǎo)儀分別測(cè)定洗脫液及流出液之PH值與離子強(qiáng)度是否相同。達(dá)到一致時(shí)關(guān)閉出水口，停止平衡。

　　4、加樣及洗脫:

　　啟開(kāi)上口橡皮塞及下口螺旋夾，使柱中液體緩慢滴出，當(dāng)柱面液體與柱面相切時(shí)，立即關(guān)閉出水口，以毛細(xì)滴管沿柱壁加入樣品（體積應(yīng)<床體積的2％，蛋白濃度以<100mg為宜）。松開(kāi)出水口螺旋夾使柱面樣品緩慢進(jìn)入柱內(nèi)，至與柱面相切時(shí)，立即關(guān)閉下口，以少量洗脫液洗柱壁2-3次；再放開(kāi)出水口，使洗液進(jìn)入床柱，隨后立即于柱面上加入數(shù)ml洗脫液，緊塞柱上口，使整個(gè)洗脫過(guò)程成一密閉系統(tǒng)。并控制流速12～14滴／分鐘。

　　5.　收集：開(kāi)始洗脫的同時(shí)就以試管進(jìn)行收集。每管收集3～5ml。共收集10～15管。

　　6.　測(cè)蛋白：以751-G型紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定每管OD280nm，與OD260nm，按前述公式計(jì)算各管蛋白含量。并以O(shè)D280nm為縱座標(biāo)，以試管編號(hào)為橫座標(biāo)，繪制洗脫曲線。

　　7.　合并、濃縮：將洗脫峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進(jìn)行合并，以PEG（MW6000）洗縮至所需體積，加入0.02％NaN３防腐劑，于4℃保存?zhèn)溆谩?/font>