隨著大家對疫情的關注度迎來又一波熱潮，對疫苗的關心和問題也沖上熱搜。

目前不同廠家的疫苗有什么區別？為什么有的疫苗只需接種一劑，有的則需要接種兩劑或三劑？應該選擇什么類型的疫苗？不同疫苗的有效性是否有差異？疫苗加強針是否應該接種，該怎么選擇？有沒有有效性更高、且穩定性好的疫苗？

關于疫苗研發的5條技術路線

我們先來了解一下什么是疫苗？

疫苗是預防和控制傳染病十分經濟、有效的手段，疫苗接種是通過誘導機體產生保護性免疫應答來預防和控制人類和動物疾病的常規方法。自疫情初期開始，我國與全球主要國家就投入了此次疫情疫苗的研發工作，并行開發了5條技術路線的疫苗，這也是目前疫苗的主要分類。

疫苗的不同技術路線：

※ 滅活疫苗

※ 減毒活疫苗

※ 基因工程亞單位疫苗

※ 腺病毒載體疫苗

※ 核酸疫苗

（含DNA和RNA疫苗）

滅活疫苗是十分傳統的平臺，而亞單位蛋白疫苗在過去幾十年中蓬勃發展，核酸和病毒載體疫苗是該領域重要的新生事物。核酸疫苗使用先進的基因工程RNA或DNA產生一種自身可以安全誘發免疫應答的蛋白質。相較于DNA而言，RNA更容易被人體識別并產生相應的抗原信息，但不會參與細胞內DNA的改造，因而更加高效且安全性更高。

不同疫苗的有效性如何呢？

此次疫苗在產量方面處于突出地位的是美國輝瑞-BioNTech和Moderna（mRNA疫苗）、阿斯利康和強生（病毒載體）以及中國國藥集團和科興（滅活）。各疫苗的有效性如何呢？世界衛生組織公布的數據如下：

從數據來看，輝瑞-BioNTech和Moderna（mRNA疫苗）有效性較高，分別為95%和94.1%。

為了應對病毒的持續變異，建議盡早接種疫苗加強針。為確保同等或更有利的免疫原性或疫苗有效性，在第一劑和第二劑接種滅活疫苗后，視產品供應情況，第三劑既可繼續接種同品牌的滅活疫苗，也可接種世衛組織緊急使用列表中的任一種 mRNA 疫苗（輝瑞或莫德納）或該病毒載體疫苗（阿斯利康Vaxzevria/COVISHIELD或楊森）。

mRNA疫苗的優勢在哪里？

代表著未來新技術的mRNA疫苗是將外源靶抗原的基因序列通過轉錄、合成等工藝制備的mRNA通過特定的遞送系統導入機體細胞，通過在體內表達目的蛋白，刺激機體產生特異性免疫學反應，從而使機體獲得免疫保護的一種核酸制劑，能實現體液與細胞的雙重免疫，有效性高。

mRNA疫苗作為一種平臺型技術，在設計和構建上具有快速性、應變性以及簡單的全合成制備等優勢，疫情在全球范圍爆發和蔓延后，隨著Moderna和BioNtech公司的mRNA疫苗在臨床上的安全性和保護效力得到進一步驗證，使得mRNA疫苗技術得到廣泛關注并推動了其快速發展。

冷凍干燥技術在mRNA疫苗研發和生產中的應用

mRNA疫苗雖然有效性高，但在生產和使用過程中依然存在一些挑戰——

① 結構不穩定；

② 容易被環境中普遍存在的RNA酶降解破壞；

③ 需要在零下-20℃～-70℃之間保存。

這就意味著全程需要冷凍儲存和冷鏈運輸，配送和使用會變得非常困難，尤其是對于醫療條件和運輸條件相對較差的非洲、南美洲和部分亞洲國家等，因此會造成由于無法按時接種終導致仍有數百萬人死于這些疾病。

                                                                                  圖2：凍干疫苗可以解決儲存運輸難題

而這些難題可以通過凍干生產相對較為干燥的產品來解決。目前，冷凍干燥技術由于其*的優勢，已被廣泛應用于抗體、疫苗等生物制藥中。

1、凍干疫苗的優勢

●   疫苗制劑在預凍前完成分裝，從而保證了劑量的精確性；

●   由于凍干是在真空和低溫狀態下完成的，因此不易發生氧化和熱變性，可以大限度地保持疫苗的理化性質和生物特性；

●   固態的冰晶升華成為水蒸氣后形成的疏松多孔（海綿狀）結構，使凍干疫苗具有非常好的速溶性和復水性，可迅速吸水溶解，恢復其原有特性；

●   凍干疫苗易進行無菌化操作，污染相對減少，臨床應用效果好，過敏等副作用少；

●  凍干疫苗脫水*，含水量低，重量輕，適合長途運輸及長期保存；

●   凍干疫苗可以在室溫下保存，減少冷鏈運輸的成本，延長貨架期。

2、凍干疫苗所面臨的挑戰

凍干疫苗具有顯著的優勢，但必須克服一些挑戰。

復雜的制劑，尤其是由多種菌株或多種抗原組成的疫苗，可能導致具有挑戰性的關鍵配方溫度和復雜的冷凍干燥過程。冷凍和干燥會對疫苗造成一定的影響，疫苗凍干過程的敏感性程度因疫苗而異。內部結冰和對疫苗成分（例如脂質膜、核酸或蛋白質）的直接損害可能是應力因素。

在冷凍過程中會形成病毒內冰晶，這會增加產品的體積并可能損壞脂質雙層（如圖3 所示）。冰還會在冰和液體之間產生新的界面，并增加表面誘導聚集的風險。

                                                                                                 圖3：冷凍干燥過程中的應力因素

在關鍵配方溫度以上干燥會導致無定形相在凍干循環的初級干燥步驟中的流動性提高。這使得蛋白質相互作用并可以提高膜通透性。

在去除結合水的二次干燥階段，可能會發生蛋白質聚集和失活。在磷脂存在的情況下，熱致相變的改變也可以提高膜滲透性。二次干燥直接影響殘留水分含量，從而影響長期穩定性。

3、凍干疫苗配方所需特性

理想的情況是，疫苗須在干燥狀態下長期儲存和液體狀態下至少保持24 小時穩定。為了實現這一目標，必須以適當的配方和工藝開發疫苗。

穩定劑（冷凍或冷凍保護劑）在開發穩定的疫苗配方中起著關鍵作用。無定形冷凍保護劑，如糖類和糖醇，在冷凍過程中通過優先排除冷凍保護劑和蛋白質的水合作用在熱力學上保持穩定（如下圖4 所示）。

                                                                                                                圖4：優先排除理論

它們還通過玻璃化作用提供動力學穩定性，從而減緩蛋白質和脂質膜的聚集。一些冷凍保護劑，如葡聚糖，不能滲透化合物，但通過增加滲透梯度，也能夠阻止內部結冰。

一些凍干保護劑，如右旋糖酐，不能滲透該化合物，但可以通過增加滲透梯度來抑制內部結冰。凍干保護劑通過替換水和磷脂或蛋白質之間的氫鍵，在冷凍干燥循環的干燥階段發揮作用(如圖5所示)。與凍干保護劑一樣，通過玻璃化來實現動力學穩定，使蛋白質和脂質膜的流動性得以實現，從而達到結構和構象的穩定。

                                                                                                             圖5：水替代理論

為了提高疫苗的穩定性，可以在制劑中加入其他賦形劑，例如緩沖劑、使表面引起的不穩定小化的表面活性劑和不太常用的賦形劑，例如填充劑、有機共溶劑和張力調節劑。

案例研究——開發一種具有三種滅活血清型的耐熱凍干脊髓灰質炎疫苗

通過使用實驗設計(DoE) 方法，用多種賦形劑評估了脊髓灰質炎疫苗的不同配方，并檢查了血清型的穩定性。用有*的賦形劑進行基本篩選沒有顯示出穩定的產品，因此進行了廣泛的篩選，成功鑒定了穩定劑。與液體制劑和其他市售脊髓灰質炎疫苗制劑相比，對佳候選物進行優化產生了具有高熱穩定性的終制劑。

4、凍干疫苗工藝開發

冷凍對產品特性有重要影響，進而影響產品穩定性(如圖6所示)。緩慢冷凍會導致形成少量的大晶體，這可能對膜有害。快速冷凍減少了滲透水釋放的時間，但是會產生更大的內部結冰風險?？焖倩蚵倮鋬鲋g的選擇是困難的，但會很容易受疫苗配方和敏感性的影響。因此，在凍干循環開發過程中研究冷凍速率對穩定性的影響至關重要。

                                                                                                                    圖6：凍結速率的影響

產品溫度在整個初級干燥步驟中至關重要，它會影響干燥時間、升華速率和穩定性。在優化疫苗的主要干燥參數時，值得考慮減少干燥時間與產品穩定性的成本效率。

在二次干燥期間去除水合殼會降低產品穩定性。殘留水分增加還會導致坍塌、聚集和降解。因此，佳殘留水分含量和二次干燥條件也應該是開發階段的一部分。

案例研究——初級干燥過程中產品溫度對長期穩定性的重要性

在所檢查的細菌疫苗的示例中，基于產品溫度(Tp) 測試了三個不同的循環，并在穩定性方面分析了產品特性。通過比較凍干后活細菌疫苗的活細胞計數來量化穩定性。

冷凍干燥后立即保守 [Tp 遠低于崩潰溫度（Tc ）但高于玻璃化轉變溫度（Tg ' ）]和激進循環（Tp 高于Tc ）之間沒有區別。

激進周期在幾天和一個月后表現不佳，中間（Tp 在Tc ）和激進周期不如保守周期好（如圖7 所示）。建議使用保守條件開始干燥周期，但對于某些疫苗制劑，高于Tc 的初級干燥可能不會導致穩定性損失。

                                                                      圖7：臨界配方溫度(CFT)與冷凍干燥條件對疫苗穩定性的影響的相關性

那么問題來了

Q1：如何準確實現凍干疫苗中關鍵配方溫度測量？

                                                                                       圖8  ：凍干顯微鏡Lyostat5及搭配使用的DSC模塊

英國Biopharma Group公司提供的凍干顯微鏡Lyostat5及可與顯微鏡搭配使用的DSC模塊，可以輕松實現配方關鍵溫度（Tc, Teu, Tg’)的測量。

Q2：如何快速實現疫苗凍干工藝開發和優化？

SP Scientific提供的Lyostar凍干機僅需運行一個遁環即可自動摸索和開發凍干工藝。結合高超的凍干PAT技術（Smart 全自動工藝開發技術，Controlyo晶核控制技術，TDLAS實時水蒸汽測量技術），使漫長復雜的工藝摸索變得簡單快捷有效。

                       圖9：Lyostar 全智能凍干工藝開發與優化

Q3：是否有凍干疫苗的案例？

輝瑞、莫德納，阿斯利康、強生均已在使用SP Scientific Lyostar智能工藝開發凍干機進行凍干疫苗的研發。

The Pfizer/BioNTech Comirnaty vaccine, 31 December 2020.

The SII/COVISHIELD and AstraZeneca/AZD1222 vaccines, 16 February 2021.

The Janssen/Ad26.COV 2.S vaccine developed by Johnson & Johnson, 12 March 2021.

滅活疫苗是傳統成熟的技術路線。RNA疫苗有效性較高，代表著未來疫苗新技術和新趨勢。冷凍干燥是提高疫苗熱穩定性的理想技術。凍干疫苗制劑開發應探索凍干保護劑和冷凍保護劑、其他穩定賦形劑的選擇以及凍干過程中的冷凍干燥工藝的影響，以防止對疫苗造成任何損害。

在開發項目中，應根據配方和工藝問題考慮對工藝條件的影響，以及它如何影響產品質量屬性。通過了解這些潛在機制，結合先進的PAT工具和QbD理論，實現快速合理開發，終獲得有效性高、長期穩定性好的預防疫苗和治療疫苗，快速預防和消除人類疾??！