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　　【化工儀器網(wǎng) 項目成果】鏈霉菌是重要的工業(yè)微生物，可以生產(chǎn)蛋白、小分子藥物等高附加值產(chǎn)品。工業(yè)生產(chǎn)中，常用隨機誘變手段產(chǎn)生大量的鏈霉菌突變庫，但缺乏與之相適配的高通量篩選手段用以獲得目標突變株。已報道的基于流式細胞分選的方法只能對鏈霉菌的原生質(zhì)體或孢子進行篩選，由于抗生素等次級代謝產(chǎn)物多產(chǎn)生于菌絲發(fā)酵的平臺期，因而原生質(zhì)體或孢子均無法代表鏈霉菌的真實發(fā)酵狀態(tài)，并不適合次級代謝產(chǎn)物的篩選；流式細胞儀也無法篩選胞外產(chǎn)物信號，因此開發(fā)鏈霉菌高效培養(yǎng)、檢測和分選的高通量篩選技術(shù)具有重要意義。
 

　　中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所研究員王猛帶領(lǐng)的高通量編輯與篩選平臺實驗室，開發(fā)了基于液滴微流控的鏈霉菌高通量篩選技術(shù)。研究調(diào)整與優(yōu)化鏈霉菌孢子液滴包埋參數(shù)及菌株液滴分選參數(shù)，使鏈霉菌高通量篩選技術(shù)的檢測分選速度達到約每小時1萬個菌株，人工混庫的單輪分選富集率超過330倍。團隊運用該技術(shù)在啟動子強度分析、啟動子改造、分泌蛋白表達等方面進行了測試應(yīng)用，對數(shù)十種內(nèi)源和異源啟動子的分析表明，液滴微流控技術(shù)測定的啟動子表達強度信號與傳統(tǒng)的酶標板和顯微鏡熒光測定結(jié)果一致；從弱啟動子ermE*p和強啟動子gapdh(EL)p出發(fā)的啟動子改造結(jié)果表明，采用液滴微流控篩選技術(shù)可以梯度改變啟動子強度，有效獲得啟動子增強或減弱的突變體，充實元件庫用于后續(xù)的代謝工程改造，基于弱啟動子ermE*p改造及篩選，獲得相比野生型強度為133.5%、343.2%和347.9%的突變體；基于強啟動子gapdh(EL)p改造及篩選，獲得強度為野生型10.1%、24.7%和94.6%的突變體；針對鏈霉菌胞外產(chǎn)物纖維素酶，應(yīng)用液滴微流控技術(shù)快速從隨機突變庫中篩選獲得纖維素酶產(chǎn)量分別為出發(fā)菌株169.2%至211.4%的多個高產(chǎn)菌株。
 

　　此外，研究表明，鏈霉菌從孢子出發(fā)可以在液滴中穩(wěn)定培養(yǎng)7天以上，完成萌發(fā)、分化、進行各種生物合成直至走向衰亡的完整生命周期。這一特性使開發(fā)的基于液滴微流控的鏈霉菌高通量篩選平臺可以用于菌體生長早期對于啟動子等調(diào)控元件的篩選，也可以用于生長中期對于胞內(nèi)、胞外目標蛋白的篩選，且在次級代謝產(chǎn)物如抗生素等篩選方面具有應(yīng)用前景。
 

　　科研團隊撰寫的博客發(fā)表在Nature Portfolio Bioengineering Community的專欄Behind the paper上，從形態(tài)學角度探討了液滴微流控篩選方法與絲狀微生物的適配性，為該平臺在更多絲狀微生物改造和篩選方面的應(yīng)用提供了新思路。
 

　　相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在Communications Biology上。研究工作得到國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金、中科院重點項目及天津市合成生物技術(shù)創(chuàng)新能力提升行動的支持。
 

基于液滴微流的鏈霉菌高通量篩選技術(shù)示意圖
 

不同啟動子的強度分析比較圖：a、酶標儀，b、液滴微流控，c、熒光顯微鏡