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　　圖. 基于拓展遺傳密碼體系的長鏈RNA位點(diǎn)特異性金納米顆粒標(biāo)記新技術(shù)(A-B)及X射線散射干涉技術(shù)在長鏈RNA中的應(yīng)用(C)

 

　　在國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(批準(zhǔn)號：U1832215)的資助下，清華大學(xué)方顯楊研究員團(tuán)隊(duì)在發(fā)展長鏈RNA位點(diǎn)特異性標(biāo)記納米顆粒新方法及拓展X射線散射干涉技術(shù)應(yīng)用于長鏈RNA研究中取得進(jìn)展。相關(guān)研究成果以“基于拓寬遺傳密碼轉(zhuǎn)錄的長鏈RNA位點(diǎn)特異性共價標(biāo)記納米顆粒技術(shù)(Site-specific covalent labeling of large RNAs with nanoparticles empowered by expanded genetic alphabet transcription)”為題，于2020年8月31日發(fā)表在《美國科學(xué)院院報(bào)》(PNAS)雜志上。論文鏈接：https://doi.org/10.1073/pnas.2005217117。
 

　　RNA的結(jié)構(gòu)-功能研究是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的前沿?zé)狳c(diǎn)和難點(diǎn)。由于RNA自身的柔性和分子量限制，應(yīng)用傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法包括X射線晶體學(xué)、核磁共振和冷凍電鏡技術(shù)來研究非常困難，目前RNA的三維空間結(jié)構(gòu)信息還非常少。為研究RNA的結(jié)構(gòu)，可通過向RNA分子中位點(diǎn)特異性引入一些探針或標(biāo)記物，借助X射線散射干涉等新的研究手段，發(fā)展RNA的整合結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究方案。X射線散射干涉(XSI)是基于小角X射線散射技術(shù)(SAXS)的一種新分子標(biāo)尺，通過向生物大分子位點(diǎn)特異性標(biāo)記上單個或成對的金納米顆粒，可提供20-400埃范圍內(nèi)的位點(diǎn)特異性距離信息，因而在生物大分子的結(jié)構(gòu)與動態(tài)特性研究中具有較大潛力。目前蛋白質(zhì)和DNA的位點(diǎn)特異性標(biāo)記已有多種技術(shù)方案，而RNA的位點(diǎn)特異性標(biāo)記主要是通過固相化學(xué)合成實(shí)現(xiàn)的，這一方案通常對長度小于100個核苷酸的RNA適用，當(dāng)前XSI的應(yīng)用主要局限在短鏈RNA，而長鏈RNA的位點(diǎn)特異性標(biāo)記具有很大的挑戰(zhàn)性。
 

　　為突破位點(diǎn)特異性標(biāo)記RNA分子量限制的瓶頸，推廣XSI在長鏈RNA結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用，發(fā)展RNA整合結(jié)構(gòu)生物學(xué)方案，該項(xiàng)研究利用包含NaM-TPT3非天然堿基核苷酸對的拓展遺傳密碼體系，通過化學(xué)合成堿基帶有氨基修飾的TPT3(rTPT3A)(圖A)，經(jīng)過PCR和體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在RNA中位點(diǎn)特異性的引入TPT3A，進(jìn)一步利用NHS-氨基化學(xué)反應(yīng)的高選擇性，通過與氨酰基修飾的金納米顆粒反應(yīng)，建立了長鏈RNA位點(diǎn)特異性金納米顆粒標(biāo)記的策略(圖B)。應(yīng)用上述標(biāo)記策略，成功實(shí)現(xiàn)了對來源于登革病毒的位于其基因組RNA3’非翻譯區(qū)長度為97個核苷酸的3’SL元件和長度為719個核苷酸DENV-Mini RNA元件的位點(diǎn)特異性金納米顆粒的標(biāo)記，并應(yīng)用XSI分子標(biāo)尺測定了標(biāo)記位點(diǎn)間的距離(圖C)。
 

　　該標(biāo)記策略突破了此前RNA位點(diǎn)特異性標(biāo)記在分子量上的限制，將拓展X射線散射干涉技術(shù)在長鏈RNA研究中的應(yīng)用。