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　　圖. 基于拓展遺傳密碼體系的長鏈RNA位點特異性金納米顆粒標記新技術(A-B)及X射線散射干涉技術在長鏈RNA中的應用(C)

 

　　在國家自然科學基金項目(批準號：U1832215)的資助下，清華大學方顯楊研究員團隊在發展長鏈RNA位點特異性標記納米顆粒新方法及拓展X射線散射干涉技術應用于長鏈RNA研究中取得進展。相關研究成果以“基于拓寬遺傳密碼轉錄的長鏈RNA位點特異性共價標記納米顆粒技術(Site-specific covalent labeling of large RNAs with nanoparticles empowered by expanded genetic alphabet transcription)”為題，于2020年8月31日發表在《美國科學院院報》(PNAS)雜志上。論文鏈接：https://doi.org/10.1073/pnas.2005217117。
 

　　RNA的結構-功能研究是結構生物學的前沿熱點和難點。由于RNA自身的柔性和分子量限制，應用傳統的結構生物學方法包括X射線晶體學、核磁共振和冷凍電鏡技術來研究非常困難，目前RNA的三維空間結構信息還非常少。為研究RNA的結構，可通過向RNA分子中位點特異性引入一些探針或標記物，借助X射線散射干涉等新的研究手段，發展RNA的整合結構生物學研究方案。X射線散射干涉(XSI)是基于小角X射線散射技術(SAXS)的一種新分子標尺，通過向生物大分子位點特異性標記上單個或成對的金納米顆粒，可提供20-400埃范圍內的位點特異性距離信息，因而在生物大分子的結構與動態特性研究中具有較大潛力。目前蛋白質和DNA的位點特異性標記已有多種技術方案，而RNA的位點特異性標記主要是通過固相化學合成實現的，這一方案通常對長度小于100個核苷酸的RNA適用，當前XSI的應用主要局限在短鏈RNA，而長鏈RNA的位點特異性標記具有很大的挑戰性。
 

　　為突破位點特異性標記RNA分子量限制的瓶頸，推廣XSI在長鏈RNA結構研究中的應用，發展RNA整合結構生物學方案，該項研究利用包含NaM-TPT3非天然堿基核苷酸對的拓展遺傳密碼體系，通過化學合成堿基帶有氨基修飾的TPT3(rTPT3A)(圖A)，經過PCR和體外轉錄反應，在RNA中位點特異性的引入TPT3A，進一步利用NHS-氨基化學反應的高選擇性，通過與氨酰基修飾的金納米顆粒反應，建立了長鏈RNA位點特異性金納米顆粒標記的策略(圖B)。應用上述標記策略，成功實現了對來源于登革病毒的位于其基因組RNA3’非翻譯區長度為97個核苷酸的3’SL元件和長度為719個核苷酸DENV-Mini RNA元件的位點特異性金納米顆粒的標記，并應用XSI分子標尺測定了標記位點間的距離(圖C)。
 

　　該標記策略突破了此前RNA位點特異性標記在分子量上的限制，將拓展X射線散射干涉技術在長鏈RNA研究中的應用。